徐氏祖居苏州，以务农为业，后迁至上海。徐光启的祖父因经商而致富，及至父亲徐思诚家道中落，仍转务农。嘉靖四十一年（1562年）徐光启出生于太卿坊（今上海市黄浦区乔家路）。少年时代的徐光启在龙华寺读书。万历九年（1581年）应金山卫试中秀才后，他在家乡教书，并娶本县处士吴小溪女儿为妻。二十一年(1593年)，徐光启赴广东韶州任教，并结识了耶稣会士郭居静。二十四年(1596年)年转至广西浔州任教。

万历二十五年(1597年)，徐光启因考官焦竑赏识而以顺天府解元中举。次年会试他未能考中进士，便回到家乡教书。二十八年（1600年）他赴南京拜见恩师焦竑，与耶稣会士利玛窦第一次晤面。三十一年(1603年)，他在南京由耶稣会士罗如望（Jean de Rocha）受洗加入天主教，获教名保禄（Paul）。

万历三十二年（1604年）徐光启中进士，考选翰林院庶吉士。三十四年（1606年）他开始与利玛窦合作翻译《几何原本》前6卷，次年春翻译完毕并刻印刊行。翻译完毕《几何原本》后，他又根据利玛窦口述翻译了《测量法义》一书。万历三十五年（1607年）三年翰林馆期满告散，他被授予翰林院检讨。

同年徐光启的父亲在北京去世，他回乡丁忧守制。第二年邀请郭居静至上海传教，这成为天主教传入上海之始。守制期间，他整理定稿了《测量法义》，并将《测量法义》(歧义是什么意思？歧义句意思就是：句子可以这样理解，也可以那样理解，但却不能确定究竟要表达哪种意思。)与《周髀算经》、《九章算术》相互参照，整理编撰了《测量异同》；作《勾股义》一书，探讨商高定理；开辟双园、农庄别墅，进行农作物引种、耕作试验，作《甘薯疏》、《芜菁疏》、《吉贝疏》、《种棉花法》和《代园种竹图说》。

万历三十八年（1610年）徐光启回到北京，官复原职。因钦天监推算日食不准，他与传教士合作研究天文仪器，撰写了《简平仪说》、《平浑图说》、《日晷图说》和《夜晷图说》。四十年（1612年），他向耶稣会教士熊三拔（P. Sabbathino de Ursis）学习西方水利，合译《泰西水法》6卷。

万历四十一年（1613年）初冬，因与朝中一些大臣意见不合，徐光启告病去职前往天津。他在房山、涞水两县开渠种稻，进行各种农业实验，先后撰写了《宜垦令》、《农书草稿》（北耕录）等书，为《农政全书》的编写打下了基础。

万历四十四（1616年）年礼部侍郎沈榷连上三张奏疏，请求查办外国传教士，是为南京教难。徐光启上《辩学章疏》为传教士辩护。同年徐光启回京复职，次年任詹事府左春坊左赞善。后病归天津，作《粪壅规则》。

万历四十六年（1618年）后金努尔哈赤发兵进犯关内，徐光启应召星夜入京。四十七年（1619年）萨尔浒之战明军战败，他多次上疏请求练兵，后擢升少詹事兼河南道御史，在通州督练新军。但由于军饷、器械供应困难，练兵计划并不顺利。天启元年(1621年)三月徐光启上疏回天津养病；六月辽阳失陷，他又奉召返京，力请使用红夷大炮帮助守城，但因与兵部尚书意见不合，十二月再次辞归。

天启三年（1624年），徐光启擢升为礼部右侍郎兼侍读学士等职，当时朝中魏忠贤专权，他不肯就任，次年他便遭谗劾去职。徐光启回到上海后，将积累多年的农业资料“系统地进行增广、审订、批点、编排”，编撰而成后来的《农政全书》。他同毕方济（P.Franciscus Sambiasi）一起合译了《灵言蠡勺》。他还把自己关于军事方面的文章辑录成书，刻印刊行了《徐氏庖言》。

崇祯元年（1628年）徐光启奉召回京，官复原职。二年（1629年），他又擢升礼部左侍郎。因钦天监推算日食失准，崇祯皇帝同意由徐光启主持开局修历。同年，皇太极率领兵数万人进逼京畿，崇祯帝召集大臣平台议事，徐光启奏对战守之事。三年（1630年），升任礼部尚书。四年起，陆续进献历书多卷，即《崇祯历书》。五年（1632年），以礼部尚书兼东阁大学士，入参机务。六年（1633年），加太子太保、兼文渊阁大学土，同年11月8日病逝于任上。谥文定。

徐光启《农政全书》遗稿经陈子龙修订，编成60卷，于崇祯十二年（1639年）刊行。崇祯十四年(1641年)徐光启归葬于上海徐家汇。